Полученный от живых пчел (например, путем ужаления стекла) пчелиный яд представляет собой густую, прозрачную жидкость горько-жгучего вкуса, кислой реакции (рН водных растворов 4,5-5,5), плотностью 1,08-1,13. Секрет содержит около 40% сухого остатка и на воздухе через несколько минут затвердевает. Высушенный яд имеет вид прозрачной массы, которая при очистке со стекла превращается в порошок от белого до желтоватого оттенка — яд-сырец.
Пчелиный яд, полученный методом электростимуляции, отличается от вышеописанного несколько большим количеством примесей, соответственно, большей вариацией цветности. Однако удельная активность, качество яда мало уступает нативному яду. В связи с высокой гетерогенностью яда, разные его компоненты обладают неодинаковой сохранностью и устойчивостью к разным воздействиям. Они реагируют с окислителями, кислотами, щелочами. Свет и температура также разрушают полученный продукт, его составные компоненты. При этом чем сложнее структура молекулы, тем менее устойчива она к воздействию. Например, самая неустойчивая к повышенной температуре гиалуронидаза яда. Этот фермент разрушается уже через 25 минут после нагревания до 100° С. Фосфолипаза более устойчива — она выдерживает часовое нагревание при названной температуре. Наиболее стабилен мелиттин. Этот полипептид выдерживает нагревание при 110°С в течение 1,5 часа.
Из изложенного следует, что получить качественный яд непросто, также непросто обеспечить его сохранность. Какими же требованиями руководствоваться при оценке качества яда? Для этого существует несколько методов, часть из которых является официальной, применяемой в отечественной практике.
Все предложенные методы можно разделить на две группы: физико-химические и биологические. Первые дают точные результаты. Однако они в основном не являются специфичными, и, главное, не отражают качество продукта в отношении его активности — т.е. его воздействия на организм.
При оценке активности пчелиного яда в отношении его воздействия на организм приоритетными по логике и эффективности являются биологические тесты. Еще с 1897 года предложено использовать для этого реакцию развития конъюнктивита у кроликов при закапывании им растворов яда в конъюнктивальный мешок. В дальнейшем развивались методы, основанные на проявлении токсических свойств яда при действии на бактерии, инфузории, нематоды и т.д. В настоящее время из подобных биологических методов наиболее широко используется тест определения острой токсичности (ДЛ50) при введении яда лабораторным мышам. При этом допускается внутривенное и внутрибрюшного введение растворов яда, с расчетом средней смертельной дозы, вызывающей гибель 50% мышей из группы в течение 24 часов.
Аналогично используются методы, основанные на известных патофизиологических свойствах яда. Так, можно оценивать яд по его способности снижать уровень аскорбиновой кислоты в надпочечниках, вызывать реакцию преципитации в сыворотке крови иммунизированных ядом животных, помутнение растворов яда с гепарином.
Биологическая активность яда формируется из активностей составляющих его компонентов. Поэтому наиболее эффективны методы, позволяющие определить активность наиболее важных компонентов яда: мелиттина, фосфолипазы А, гиалуронидазы. Из вышеприведенных данных о химическом составе и свойствах видно, что именно эти компоненты играют активную роль в суммарном патофизиологическом эффекте яда.
Начиная с конца прошлого столетия, используется тест гемолиза (разрушения красных кровяных клеток). Способность пчелиного яда вызвать гемолиз эритроцитов является результатом действия его компонентов: мелиттина и фосфолипазы А. Прямое гемолизирующее действие мелиттина было доказано на том основании, что пчелиный яд вызывает непосредственный гемолиз эритроцитов, в то время как яды змеи, несмотря на наличие в них фосфолипазы А, этим свойством не обладают или гемолизируют эритроциты лишь в незначительной степени. Фосфолипаза А действует на эритроциты путем отщепления молекулы ненасыщенной жирной кислоты от молекулы лецитина, в результате чего образуется лизолецитин, который, в свою очередь, вызывает гемолиз. Таким образом, в процессе гемолиза эритроцитов, видимо, существует синергизм действия обоих компонентов пчелиного яда: мелит-тин действует на эритроциты, и в результате освобождается лецитин, который затем под воздействием фосфолипазы А переводится в лизолецитин, усиливающий гемолиз.
Кроме гемолитического теста, определяющего активность мелиттина и фосфолипазы А, применяется и непосредственное определение ферментативной активности яда. При этом руководствуются тем, что и фосфолипаза А и гиалуронидаза являются ферментами, т.е. веществами, катализирующими (ускоряющими) определенные реакции в организме или в пробирке. На основании этих реакций вычисляется ферментативная активность в единицах действия — чем выше активность фермента, тем большее количество единиц действия он содержит. Поясним сказанное следующим примером. Имеется фермент А, который ускоряет расщепление (заставляет разрушаться) вещество Б (субстрат). В результате вещество Б распадается на молекулу С и Д. Соответственно, чем выше активность фермента, тем больше в растворе появится молекул С и Д. Остается их сосчитать. Это трудно, да и незачем. Можно добавить в пробирку вещество И (индикатор), которое свяжет или С или Д. Остается подобрать такое вещество И, чтобы в результате его реакции с С или Д, образовалось вещество К, поглощающее свет. Такое вещество окрасит раствор, он будет цветным. При этом чем ярче цвет, тем больше молекул его образует, тем больше их в растворе. Интенсивность же окраски раствора можно измерить приборами — фотоколориметрами, спектрофотометрами и т.д. Так косвенно можно вычислить не только активность, но и количество молекул фермента.
В настоящее время используют измерение активности фосфолипазы и гиалуронидазы в международных единицах действия. Разумеется, методы определения ферментативной активности, по сути, активности яда, достаточно сложны и требуют как соответствующего лабораторного оборудования, так и определенных навыков работы.
Некоторые из приведенных методов вошли в показатели качества пчелиного яда, оформленные в виде стандартов. Первый из них: технологические условия (ТУ 46 РСФСР 67-72) устарели, и сегодня пользуются в основном Фармакопейной статьей СССР (ФС 42-26583-89 «Яд пчелиный»), разработанной нами совместно с Рижским мединститутом. Ниже приводятся показатели указанной ФС — показатели качества пчелиного яда .
Как следует из таблицы, некоторые показатели можно определить, не прибегая к биохимическим методам. Ниже приводится методика определения физико-химических показателей (примесей и влажности), имеющих важное значение для коррекции процесса отбора яда, которые можно выполнить в условиях пасеки, при наличии термостата и соответствующей посуды
Определение потери массы пчелиного яда при высушивании (влажность)
Определение потери массы при высушивании образцов пчелиного яда проводится согласно ГФ X, С. 760 и ГФ XI, Т. 1, С. 176 (Государственная фармакопея СССР X изд., 1986; Государственная фармакопея СССР XI изд., 1987).
Методика. Около 0,1 г (точная навеска) по 3 навески каждого образца пчелиного яда высушивают при температуре 100-105° до постоянной массы.
Подсчет результатов: потери массы при высушивании в % (с точностью до 0,1 процента) вычисляют по формуле:
Определение нерастворимых в воде примесей и золы в пчелином яде
Нерастворимые в воде примеси в образцах яда пчелиного определяют согласно методике по ТУ-46 Латв. ССР 804-78 в модифицированном виде (Батова Р.С., 1991).
Около 0,1 г (точная навеска), по три навески каждого образца яда пчелиного растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. Раствор пропускают через высушенный до постоянной массы стеклянный фильтр № 3. Осадок из колбы количественно переносят на фильтр и фильтр промывают 50 мл воды. Фильтр с осадком сушат до постоянной массы при температуре 100-150°С.
Из других важных требований к качеству пчелиного яда, кроме указанных в Фармакопейной статье, следует указать практикующуюся иногда оценку общей токсичности яда, — по величине дозы острой токсичности ДЛ50 методом, указанным выше.
В свете современных требований к чистоте получаемых продуктов, в отношении пчелиного яда допускается его проверка на радиоактивность. Мы считаем, что такой анализ следует проводить, измеряя уровень загрязнения радиоактивными продуктами цезием и стронцием, которое не должно превышать ПДК, установленное для пищевых продуктов.
Однако наиболее важными из параметров, характеризующих качество пчелиного яда, после оценки биологической активности, является определение количественного содержания наиболее значимых компонентов в яде-сырце. Наиболее точно это достигается путем хроматографического разделения цельного яда на составляющие фракции. Яд растворяется в определенном растворе и пропускается в таком состоянии через колонку, заполненную веществом, которое адсорбирует компоненты яда. Дело в том, что такая адсорбция различна для разных компонентов из-за их различия в массе, электрическом заряде молекул, отношению их к растворителю. В результате на выходе из колонки разные компоненты (фракции) будут выходить в разное время. Пользуясь этим, порции раствора, разделенные во времени, можно направить в соответствующий анализатор, где определяется количество той или иной
фракции яда. При этом чем сложнее аппаратура, тем больше фракций можно выявить и проанализировать. В современных жидкостных хроматографах вышеуказанные процессы автоматизированы, и на выходе дается машинная распечатка содержания того или иного компонента в пчелином яде.
Указанный метод хроматографического разделения пчелиного яда на компоненты оказался очень удобным не только для анализа яда, но и для промышленного (препаративного) получения этих компонентов. Для этого необходимо лишь увеличить объем колонок и скорость пропускания через них раствора, что, в свою очередь, можно осуществить, прикладывая высокое давление на вход колонки. На этих принципах создан метод «Высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления». Именно этим методом сегодня получают чистые фракции (компоненты) пчелиного яда. Разумеется, метод сложен и дорог, о чем можно судить по той цене, по которой продают пчелиный яд и его компоненты на мировом рынке. Так, американская фирма «Сигма», продавая 1 г пчелиного яда за 242 доллара США, оценивает мелиттин яда в 155 долларов за 25 мг, а~апамин — в 307 долларов за 5 мг.
Для экспресс-анализа полученного на пасеке пчелиного яда, можно воспользоваться предложенным нами методом апитокситографии, указанным выше.
Определение качества сырья, содержащего пчелиный яд, апитоксиавтографическим методом осуществляется по следующей схеме.
Сырье, содержащее пчелиный яд в сухом виде, в количестве от 50 до 500 мкг наносят (распыляют) на фотографическую эмульсию, предварительно обработанную активным рассеянным светом в течение 30 с — 3600 с и смоченную водой. Фотоэмульсию с нанесенным сырьем выдерживают 60-300 с и затем обрабатывают в растворах стандартного проявителя и фиксажа до появления ярко выраженного контраста. При наличии в сырье пчелиного яда, на поверхности фотоэмульсии регистрируются следы пчелиного яда в виде пятен низкой оптической плотности.
‘ Для количественного определения яда готовят шкалу автографов пчелиного яда, по которой путем визуального сравнения с автографом сырья можно определить содержащееся в нем количество пчелиного яда. Минимальная чувствительность способа — 50 мкг яда. При меньшем содержании яда в сырье не удается визуально обнаружить его автограф. Предельная максимальная чувствительность способа — 500 мкг яда. При большем содержании яда в сырье светлые пятна — автографы сливаются, что препятствует количественному определению яда в сырье. Шкала автографов для количественного определения яда изготавливается следующим образом.