БЕЛКИ ПЧЕЛИНОГО ЯДА
Фосфолипаза А2- Относится к группе ферментов, осуществляющих расщепление жиров (липидов). Вообще эти ферменты (липазы) являются неотъемлемой частью животных организмов и содержатся в их тканях повсеместно — в клетках, в кишечнике и т.д. Так, поступающие в организм жиры пищи расщепляются липазами в кишечнике до глицерина и жирных кислот и в таком виде всасываются в ворсинках кишечника. Другие липазы — фосфолипа-зы, осуществляют расщепление фосфолипидов (фосфоглицеридов). Важно отметить, что фосфолипиды — основное вещество, из которого состоит оболочка (мембрана) клеток. Примерно 80% всех липидов, составляющих бислойную структуру мембран, — это фосфолипиды. Содержащиеся в клеточных органеллах — вакуолях, лизосомах и др. — фосфолипазы участвуют в обновлении тканей по мере их износа — путем разрушения отработанных, старых мембран.
Именно это свойство — разрушение клеточных мембран и проявляется главным образом при действии на организм фосфолипазы пчелиного яда. При этом фосфолипаза А2 яда, в отличие от фосфолипаз А|, В и Д, расщепляет эфирную связь глицерина и жирной кислоты во 2-ом положении, возможно, наиболее труднодоступном. Во всяком случае, известно, что при расщеплении жиров липазами связи 1 и 3-триацилглицерида гидролизуются быстро, и лишь потом идет медленный гидролиз 2-моноглицерида. Поэтому можно предположить, что при высоком содержании в яде (на втором месте после мелиттина) фосфолипаза А2 весьма эффективно справляется с функцией разрушения мембраны клетки.
Габерманн и Нейман (1952-1965), впервые выделившие активный фермент из пчелиного яда, определили его содержание около 14% в расчете на высушенный яд. Позднее Шаполини с сотр. (1967-1972) установили, что фосфолипаза яда состоит из разных «субформ», различающихся по содержанию в них углеводов. Поэтому трудно дать точное определение молекулярной массы фермента. Как видно из таблицы, она варьирует, видимо, в зависимости от степени очистки, от 14000 до 20000 единиц (дальтонов). Тем не менее, Шаполини с сотрудниками установили, что фермент состоит из 128 аминокислотных остатков и установили их последовательность.
Фосфолипаза пчелиного яда является наиболее устойчивой из его ферментов. Она сохраняет свою активность при длительном хранении высушенного яда. Оптимальная ферментативная активность фосфолипазы в отношении фосфолипидов куриного яйца проявляется при рН 8,0. У фермента высокий температурный оптимум—60-65°С.
Биологические свойства фосфолипазы яда обусловлены ее биохимической активностью. Кроме эффекта расщепления фосфоли-пида, фосфолипаза производит еще и триггерный эффект. Дело в том, что при разрыве эфирной связи жирной кислоты и глицерина образуется лизолецитин (лизофосфатидилхолин), обладающий сильными поверхностно-активными свойствами. Указанные свойства лизолецитина обеспечивают дальнейшую деструкцию мембран еще в большей мере, чем самой фосфолипазы. Это отметил еще Лангер (1897), добавляя лецитин куриного яйца в систему: пчелиный яд — кровь и наблюдая усиление гемолитической активности яда. Исходя из механизма действия фермента, можно объяснить многие эффекты токсического действия пчелиного яда на разные органы и ткани организма: разрушение мембран эритроцитов
— гемолитическое действие; разрушение мембран органелл клеток
— так как все они состоят из аналогичных внешней оболочке клетки мембран, бислои которых выполнены фосфолипидами, — нарушение клеточных функций; — нарушение свертывания крови — так как в составе факторов свертывания имеются фосфолипидсо-держащие компоненты и т.д. Соответственно, например, повреждение мембран митохондрий приведет к нарушению окислительно-восстановительных процессов выработки энергии, повреждение структуры нервных окончаний приведет к нарушению выработки
и переноса медиаторов, т.е. нарушению проведения нервного импульса и т.д.
Возникшие под действием фосфолипазы нарушения на клеточном и субклеточном уровне приведут соответственно к нарушениям функций организма. Так, введение фосфолипазы под кожу вызывает местное воспаление, а внутривенное введение приводит к падению кровяного давления, отеку легких, кровоизлияниям в тканях.
Ввиду того, что фосфолипаза является высокомолекулярным чужеродным белком для организма, подвергнувшегося воздействию яда, она является сильным антигеном и аллергеном. Отсюда весьма значительное число случаев анафилактического шока при пчелиных ужалениях. У большинства ужаленных пчелами людей в крови обнаруживается большое количество IgE антител с соответствующим уменьшением IgC (Hoffman et al., 1977; Kemeny et al., 1983).
Считается, что фосфолипаза А2 из пчелиного яда является самой активной из фосфолипаз этой группы: она существенно активнее аналогичных фосфолипаз из змеиных ядов, превосходит активность фосфолипазы А2 кишечника человека. В молекуле имеется 12 остатков цистеина, взаимосвязанных дисульфидными мостиками. Предполагается, что сульфгидрильные группы, имеющиеся в белках мембран клеток, реагируют с сульфгидрильными группами фермента и, таким образом, обеспечивается воздействие фосфолипазы на фосфолипиды мембран. При этом наибольшей восприимчивостью обладает внешний, гидрофильный полюс молекул фос-фолипидов. Поэтому разрушение бислоя мембраны начинается с наружной стороны. Далее разрушительную работу продолжают и усиливают как образующиеся продукты (лизолецитин и др.), так и другие компоненты яда. Установлено, что добавление мелиттина в таких условиях резко повышает скорость разрушения мембраны клетки (Habermann, 1980).
Гиалуронидаза. Биологическое назначение этого фермента пчелиного яда сводится к организации путей для токсических компонентов в направлении функциональных структур клеток и органов ужаленного организма. В связи с этим собственная токсическая активность гиалуронидазы незначительна, если не считать аллер-гентных свойств, присущих ей как высокомолекулярному чужеродному агенту. Однако для проявления общего эффекта яда указанное назначение фермента в яде незаменимо. Дело в том, что межклеточное связывающее вещество, соединяющее клетки органов
между собой в единый остов, представляет собой вязкий гель высо-кополимеризованной гиалуроновой кислоты и протеогликанов — также полимерных веществ большой молекулярной массы, содержащих полисахариды, связанные с полипептидами. Вещества, в норме транспортируемые из кровеносных капилляров в клетки ткани, должны диффундировать через этот гель, который не препятствует прохождению небольших ионов, воды, глюкозы, аминокислот и т.п., но служит непроходимым барьером для больших молекул, таких, как белки, пептиды.
Этот высокоструктурированный гель межклеточного вещества может быть разрушен ферментами — гиалуронидазами, расщепляющими связи гиалуроновой кислоты и протеогликанов. Такие ферменты зволюционно присутствуют у разных организмов и структур, жизненной необходимостью которых является проникновение в ткани инородного организма. Поэтому гиалуронидазы присутствуют у сперматозоидов, патогенных микроорганизмов, пиявок, змей, насекомых и др. В этом плане гиалуронидаза пчелиного яда является наиболее активным из известных ферментов этой группы. Интересно отметить, что в яде пчелиной матки, которой нет необходимости жалить млекопитающих, количество этого «фактора распространения» яда существенно ниже, чем в яде рабочих пчел.
Впервые выделивший гиалуронидазу Габерманн (1965), получил фермент, в 40 раз более активный, чем в нативном пчелином яде. Оказалось, что гиалуронидаза пчелиного яда по своим свойствам сходна с аналогичными ферментами, полученными из других источников. Однако оптимум действия фермента лежит в более кислой среде: 4,0-5,0. Фермент термолабилен и при нагревании теряет свою активность. Стабильность его также невысока и снижается при хранении в обычных условиях. Это один из самых высокополимерных компонентов яда. Его молекулярная масса составляет 35000-41000 дальтонов, в зависимости от степени очистки от присоединенных к пептидной цепи молекулы углеводов (Ivanov et al., 1972; Kemeny et al., 1984). От степени очистки, а также от методов получения пчелиного яда зависит также и количество фермента. Оно составляет 1-3% от массы высушенного яда.
Таким образом, при ужалении и попадании яда в ткани организма млекопитающих гиалуронидаза, расщепляя высокомолекулярные структуры гиалуроновой кислоты и других полимеров соединительной ткани, «разжижает» гель межклеточного вещества и
тем самым снимает барьер для проникновения токсических компонентов яда к функциональным группам клеток.
В силу указанных причин препараты некоторых гиалуронидаз с успехом используются в медицине для рассасывания шрамов, рубцов при заживлении ран и ожогов кожи и слизистых поверхностей, так как рубцы и шрамы формируются соединительной тканью. С другой стороны, необходимо учитывать существенные аллергснт-ные свойства фермента. Возможно, именно гиалуронидаза способствует выработке сверхчувствительности к пчелиному яду определенной группы людей.
Кислая фосфатаза (фосфомоноэстераза), выделенная Benion (1967), присутствует в яде в количестве около 1% и способствует разрушению фосфолипидов фосфолипазой А2. Она не разрушает аденозиновых фосфатов, но активно отщепляет фосфаты с 1 и 2 позициями у глицериновых и с 1 места — сахарных фосфатов. Oqi-мент термолабилен, его масса лежит в пределах 45000-90000, от и мум рН составляет 4-3, проявляет высокие антигенные свойства.
Альфа-глюкозидаза содержится в яде в еще меньших количествах — 0,5%. Представляет собой гликопротеид и имеет самую большую молекулярную массу —- 170000 (Шкендеров, 1974). Проявляет альфа-гликозидазную активность при температурном оптимуме 46°С. Является антигеном, однако не проявляет токсических свойств.
Лизофосфолипаза — еще один фермент пчелиного яда, работающий комплексно с другими фосфолипазами. Охарактеризован Шкендеровым, Ивановой (1982). Авторы установили, что фермент является гликопротеидом с молекулярной массой 22000 дальтонов. В аминокислотном составе не обнаружено цистина, метионина и тирозина. Фермент расщепляет лизолецитин. Он отщепляет единственную жирную кислоту, находящуюся на первом месте молекулы токсичного лизолецитина, превращая его в нетоксичное соединение. В условиях, когда лизолецитин образуется под влиянием фосфолипазы пчелиного яда, это действие лизолецитина можно определить как защитное, антитоксическое. Биологический смысл такого эффекта непонятен.
ПЕПТИДЫ ПЧЕЛИНОГО ЯДА
Пептидами называют сравнительно небольшие молекулы белковой природы с молекулярной массой условно до 5000. Этим они отличаются от собственно белков, молекулярная масса которых
варьирует от 5000-10000 до 1 млн. и более. Соответственно количество аминокислотных звеньев, из которых построены белки и пептиды, будет различно. У пептидов оно исчисляется единицами и десятками, тогда как у белков счет идет на десятки и сотни аминокислот. К пептидам относятся многие природные вещества с важными биологическими функциями, а также продукты расщепления белков. Как видно из таблицы о составе пчелиного яда, содержание в нем класса пептидов представлено достаточно широко. При этом одни пептиды составляют основную массу яда (мелиттин), другие (минорные) пептиды содержатся в минимальных количествах.
Мелиттин В 1952 году Нейман и Габерманн методом электрофореза разделили белки пчелиного яда на две фракции. В первой фракции, более подвижной в направлении анода, был выявлен по-липептнд, непосредственно разрушающий эритроциты и вызывающий сокращение гладких мышц, впоследствии названный мелитти-ном -от видового названия пчелы — меллифера (медоносная). Авторы установили его содержание в яде в количестве 40-55% и определили его первичную структуру. Молекула пептида содержит 26 амннокшмотпых остатков, С-концевая карбоксильная группа его амидировапа: Гли-Иле-Гли-Ала-Вал-Лей-Лиз-Вал-Лей-Тре-Тре-Гли-Лен-Ала-Лей-Иле-Сер-Три-Иле-Лиз-Арг-Лиз-Арг-Глн-Глн-NH,.
Из аминокислот, обычно составляющих белки, в составе мелит-тииа пет шрозина, фенилаланина, аспаргиновой кислоты, метио-пина, цисгина. Мелиттин содержит только один остаток триптофана в положении 19. Такие особенности кроме всего могут делать Пептид очень удобным для изучения в молекулярной биологии бе-лок-липидных взаимодействий методами флуоресценции.
Характерной особенностью молекул мелиттина является отсутствие дисульфидных мостиков. Пептид обладает выраженными основными свойствами. Это обусловлено преобладанием основных аминокислот (2 лизина и 2 аргинина) против двух остатков глута-миновой кислоты, при этом с блокированными путем амидирова-ния карбоксильными группами. В нативном яде мелиттин присутствует в двух формах: со свободной NH2-группой (90%) и с NH2-группой, замещенной на радикал муравьиной кислоты (10%). Аминокислотный состав мелиттина определяет его минимальную молекулярную массу в 3000 Да. Характерной особенностью пептида является неравномерное распределение гидрофобных и гидрофильных аминокислот. Большая часть — остатки 1-20 преимуществен-
но гидрофобны, но в С-концевой области (21-26) расположен кластер гидрофильных положительно заряженных остатков (Лиз-Арг-Лиз-Арг). Такое строение обусловливает свойства мелиттина как катионного детергента и его высокую поверхностную активность.
Основное биологическое действие мелиттина связано со способностью нарушать структуру мембран. В частности, он вызывает лизис различных клеток и является сильным гемолитиком. Биосинтез мелиттина включает образование соответствующих предшественников — препромелиттина и промелиттина. Синтез мелиттина был осуществлен Шредером в 1971 году. Ныне свойства пептида хорошо изучены. Установлено, что особенностью поведения мелиттина в растворе является его способность к агрегации и образованию тетрамеров с соответствующей массой 12000 Да. Агрегации способствуют высокие концентрации пептида, а также повышение ионной силы раствора и его рН.
Мелиттин разрушает различные природные и искусственные мембраны, однако, в отличие от других лизирующих веществ (ли-золецитин, детергенты и др.), в небольших концентрациях не вызывает растворения мембран полностью. В клетках образуются поры, сквозь которые высвобождается их содержимое, а мембраны (тени клеток) могут сохранять целостность (Габерманн, 1972 и др.). Действует мелиттин уже в концентрации 10 м. При этом образуются поры, через которые может происходить утечка не только ионов, но и макромолекул типа гемоглобина. Клеточная мембрана может быть устойчива к действию низких концентраций пептида, тогда как внутриклеточные органеллы, которых достиг мелиттин, (лизосомы, митохондрии и др.) могут быть разрушены.
В связи с относительной легкостью выделения пептида из яда-сырца и его достаточными количествами сегодня изучены многие механизмы взаимодействия мелиттина с мембранами клеток — его пространственная ориентация на поверхности мембран, места локализации на участках бислоя, каналообразующие свойства, соотношение в процессе взаимодействия с фосфолипидами системы мономер — тетрамер и т.д. (см. список литературы). Не все они бесспорны, но проясняют многие эффекты действия как цельного яда, так и самого пептида на организм.
Запасаясь в ядовитом резервуаре железы, мелиттин в большой концентрации находится в виде тетрамера, причем спиральная форма тетрамера обеспечивает защиту гидрофобной поверхности от воды, и сама молекула не активна. При попадании в ткань, растворении в жидкостях организма тетрамер диссоциирует на мо-
номеры, которые и обеспечивают взаимодействие с фосфолипида-ми мембран (рис. 2). Амфифильная молекула пептида «заякорива-ется» в наружном слое мембраны благодаря электростатическим взаимодействиям С-основного конца и анионов фосфата фосфоли-пидов и производит «клиновое» вторжение в бислой липидов мембраны (Dawson et al., 1978). В этот момент может проявиться и еще одно важное свойство мелиттина — активация фосфолипазы А яда. Возможно, именно для ее проникновения к внутренним слоям мембраны, выполненным преимущественно фосфатидилхолином и т.д., такой клин и необходимо иметь для эффективного лизирова-ния бислоя.
Физиологические и фармакологические эффекты мелиттина будут определяться теми субстратами, клетками, тканями, с которыми соприкасается этот пептид. Часть мелиттина, введенного под кожу, связывается с белками, липидами, мукополисахаридами подкожной клетчатки и соединительной ткани. С одной стороны, это существенно уменьшает токсичность пептида — установлено, что в этих условиях токсическая доза мелиттина в 15-20 раз выше, чем при внутривенном введении (Шкендеров, Иванов, 1985). Однако, с Другой стороны, происходит лизис соединительнотканных клеток-фибробластов, тучных клеток. Это приводит к выбросу из клеток
лизосомальных ферментов, серотонина, гистамина. Активируется находящаяся во многих клетках собственная фосфолипаза А организма, которая запускает синтез простагландинов — производных полиеновых жирных кислот, содержащих циклические группы, являющихся мощными биологическими регуляторами. Установлено, что синтез простагландинов начинается с гидролиза фосфолипи-дов, содержащих арахидоновую кислоту, под действием клеточной фосфолипазы А2. Кроме регуляторных свойств (тонус гладких мышц, иммунный статус и др.) простагландины являются эффекторами воспаления, пирогенами и т.д. Они же участвуют в развитии болевого эффекта. Все эти местные реакции, вызывающие воспалительную реакцию, приводят к расширению кровеносных сосудов, увеличению проницаемости капилляров, снижению кровяного давления, спазмам гладкой мускулатуры бронхов. Внешне это проявляется в возникновении боли, покраснения и отека в месте инъекции мелиттина. Антигистаминные и антисеротониновые средства значительно ослабляют указанные реакции.
Учитывая, что мелиттин реагирует со многими клеточными и неклеточными элементами, от которых зависят ферментативные реакции обмена веществ и энергии, становится понятным, почему нарушение этих реакций приводит к соответствующим эффектам. Нарушается процесс свертывания крови. Шкендеров, Иванов (1985) указывают, что угнетается активность тромбопластина, происходит денатурация фибриногена. Нарушение целостности структуры митохондрий и их связей с ферментами приводит к разобщению окислительного фосфорилирования — нарушается процесс использования и сохранения энергии клетки.
Выявлена способность мелиттина активировать гипофизарно-надпочечную систему. Эта активация проявляется гораздо позднее, чем при действии других стимуляторов этой системы. Учитывая, что гормоны надпочечников угнетают иммунные реакции, можно предполагать, что мелиттин будет угнетать иммунный ответ. Специальные исследования вышеупомянутых авторов показали, что клеточные суспензии селезенки мышей, обработанных мелиттином в дозе 100 мкг/кг, содержат в 4 раза меньше клеток, вырабатывающих иммунокомплементы по сравнению с суспензиями контрольных мышей. С этих позиций можно теоретически обосновать один из механизмов терапевтического эффекта пчелиного яда при лечении ревматических заболеваний. Считается, что в основе патогенеза подобных заболеваний лежат аутоиммунные процессы, и наиболее эффективны для их лечения противовоспали-
тельные и противоревматические средства, обладающие иммуноде-прессивными свойствами.
Сам по себе мелиттин является слабым антигеном. Он может вызывать образование антител с низкой активностью, но это действие значительно слабее, чем действие ферментов яда. Однако есть данные, что мелиттин стимулирует иммунный ответ в отношении других антигенов.
Рассматривая противовоспалительные свойства мелиттина, как и другие терапевтические его качества, следует еще раз подчеркнуть, что большое значение имеет действующая доза или концентрация пептида. Так, Шкендеров, Иванов (1985) сообщают, что при лечении модельного воспаления, вызванного палочкой Коха, лучший терапевтический эффект был получен при небольших дозах мелиттина — 20 мкг/мл, чем при больших — 100 мкг/мл. Выясняя механизмы выявленного эффекта, авторы изучили устойчивость мембран клеточных лизосом к воздействию разных концентраций пептида. Было установлено, что мелиттин в дозах 0,05-2 мкг/мл повышал устойчивость лизосомных мембран лейкоцитов и печеночных клеток. Дозы выше 10 мкг/мл вызывали типичный для пептида эффект: устойчивость лизосом снижалась вплоть до полного их распада. Аналогично влиял мелиттин на тепловую денатурацию белков: усиливал при повышении концентрации (выше 30 мкг/мл), но уменьшал денатурацию при концентрациях ниже 5 мкг/мл. Таким образом, можно заключить, что в малых концентрациях и дозах мелиттин проявляет скорее мембраностабилизи-рующую активность, чем разрушительное действие. Возможно этим следует объяснять выраженное радиозащитное действие мелиттина, установленное в экспериментах на животных, подвергавшихся облучению в летальных дозах.
Другой аргумент в пользу малых доз может быть приведен при обсуждении вопроса об активации биосинтеза простагландинов под влиянием мелиттина, о чем говорилось выше. Установлено (Джонсон с соавт., 1981), что в результате стимулирования мелит-тином системы, активирующей биосинтез простагландинов в артериальной стенке, там в несколько раз увеличивается количество простациклина-расширяющего кровеносные сосуды и понижающего свертываемость крови. По имеющимся сведениям, простацик-лины являются основными биологическими факторами, препятствующими атеросклеротическим изменениям кровеносных сосудов.
Из последних данных о физиологических эффектах мелиттина Укажем на его влияние на эндотелий >анисимые сосудистые реак-
ции. Показано, что мелиттин, взаимодействуя с мембраной клеток эндотелия кровеносных сосудов, может формировать проницаемые для ионов каналы и способствовать выделению из клеток эндотелия фактора расслабления гладкомышечных клеток сосудов (Busse et al., 1985).
Апамнн. Как полагает Габерманн, впервые выделивший этот пептид (1964, 1965), несмотря на присутствие в яде в количестве не более 2%, апамин может обладать эффектами и скрытыми физиологическими возможностями в не меньшей мере, чем основной пептид —.мелиттин, составляющий половину массы яда. Апамин — один из самых маленьких пептидов, он состоит всего из 18 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 2039 Да. Сегодня структура апамина расшифрована (Haux et al. 1967; Shipolini et al.,
В отличие от мелиттина апамин имеет две дисульфидные связи, образованные цистеинами в положениях 3-15 и. 1-11. В результате образуется достаточно жесткая структура, большая часть которой сформирована в L-спираль. В ряде лабораторий осуществлен синтез мелиттина, в том числе и в нашей стране (ин-т биоорганиче-
ской химии). В структуре апамина нет ничего характерного, что объясняло бы его специфические фармакологические свойства. Хотя можно предположить, что наличие свободных гуанидиновых групп остатков аргинина, специфически закрепленных в циклической структуре может влиять на эту специфичность.
Апамин не обладает гемолитическим действием, малоэффективен при воздействии на многие клетки млекопитающих. Однако обладает ярко выраженным действием на ряд постсинаптических мембран нервных клеток как в периферической, так и центральной нервной системе. Он обладает блокирующим эффектом на альфа-адренореактивные, холинэргические и пуринергические рецепторы. Но наиболее ярко свойства пептида проявляются по отношению к кальцийзависимым калиевым проводимостям в мембранах клеток. Причем, если раньше это утверждалось только для нейронов (Lazdunski, 1983), то недавно показано и для других тканей (Владимирова, Шуба, 1978-1986).
В соответствии с названными свойствами апамин обладает способностью дезинтегрировать взаимосвязи между клетками, что приведет к нарушению их функций как ансамблей в организме. В наибольшей степени это проявляется в виде нарушения функции центральной нервной системы. При внутривенном введении животным в количестве 1-4 мг/кг у них появляются некоординированные движения конечностей, переходящие в судороги всего тела. Повышение двигательной активности у мышей продолжается, в зависимости от дозы пептида, 30-50 часов (Шкендеров, Иванов, 1985). Поражение ЦНС при введении животным в кровь облегчается тем, что пептид, имея малые размеры и своеобразную структуру, вполне свободно проникает через гематоэнцефалический барьер в мозговую ткань. Однако специфика апамина в отношении нейронов доказывается еще и тем, что только незначительная часть его попадает в мозг — большая же часть вместе с продуктами распада скапливается в почках. Габерманн, инъецируя апамин непосредственно в мозговые желудочки крыс, показал, что в этих условиях активность пептида возрастала в 1000-10000 раз! Таким образом, апамин является специфическим токсическим агентом для ЦНС, в ничтожно малых дозах вызывая возбуждение нейронов. При этом возбуждающая и судорожная активность в большей мере проявляется на уровне спинальных отделов ЦНС, чем на уровне головного мозга. Вышеупомянутый автор доказал сказанное, непосредственно вводя апамин в разные отделы ЦНС экспериментальных животных. Обсуждая пока малоизученный механизм ре-
акций организма на введение апамина, можно предположить, что инактивируя тормозные нейроны и синапсы в ЦНС, пептид опосредованно облегчает функции возбуждающих нейронов — повышается общая возбудимость, двигательная активность, вплоть до судорог.
Кроме того, опосредованное действие апамина на возбудимость ЦНС может быть обеспечено и другими агентами возбуждения. Так, Шкендеров, Иванов, измеряя уровень основных биогенных аминов, химических посредников передачи нейронной информации, показали, что после двухнедельного инъецирования крысам апамина в дозе 20 мкг/кг количество норадреналина, его предшественника дофамина и серотонина в мозгу увеличивалось в несколько раз. При исследовании влияния апамина на активность гипофизарно-надпочечниковой системы авторами обнаружено, что внутривенное введение кошкам 10 мкг/кг пептида приводило к быстрому увеличению в крови гормонов надпочечников — адреналина и кортизола. При этом уровень гормонов через час после введения увеличивался в 8-9 раз выше исходного.
Активация апамином функций ЦНС приводит к соответствующим изменениям вегетативных функций. Выброс в кровь биологически активных эндогенных агентов может существенно сдвигать целый ряд физиологических и патофизиологических процессов. Учитывая, что адреналин и кортизол, например, угнетают течение процесса воспаления, можно предположить, что апамин обеспечивает и противовоспалительную активность пчелиного яда. Последнее убедительно продемонстрировано вышеназванными авторами на моделях воспаления, вызванного подкожным инъецированием декстрина, серотонина, суспензии возбудителя туберкулеза и др.
Изучение антигенных свойств апамина позволило заключить, что они выражены так же слабо, как и у мелиттина.
Обсуждая биологическое назначение в яде пчел апамина, следует еще раз обратить внимание на его специфическое блокирующее действие на калышйактивируемые калиевые каналы мембран клеток, которые, как недавно выяснилось, широко распространены у беспозвоночных и позвоночных животных. Даже если распределение таких каналов равномерно в разных тканях, проникновение пептида в нервную ткань приведет к дезинтеграции регуляторных процессов в организме жертвы. Последними данными показано, что подобные каналы в большом количестве представлены в нервных клетках. Более того, оказалось, что некоторые рецепторы клеток в ЦНС не только имеют сродство к апамину, но и к нормально
существующему в организме апаминоподобному фактору (Fosset et al., 1984). Авторами показано, что апаминоподобный фактор,также как и апамин,разрушается ферментом трипсином, но не подвержен влиянию химотрипсина, блокирует следовую гиперполяризацию в культурах клеток, конкурирует с апамином за места связывания на синаптосомах мозга, взаимодействует с антителами к апамину. Таким образом, можно предположить, что структура пептида эволюционно настраивалась на известные места вязыва-ния с соответствующими рецепторами в ЦНС организма жертвы, конкурируя за них с имеющимися в организме посредниками и обеспечивая дезинтегрирующее действие.
МСД-пептид (пептид 401). Давно известно, что самым первым ответом организма на ужаление является выброс гистамина из клеток окружающей ткани. Это проявляется в виде покраснения, отека и боли. Сам по себе пчелиный яд содержит малое количество гистамина, и выброс эндогенного гистамина обеспечивается разрушением тучных клеток соединительной ткани известными лити-ческими агентами яда — мелиттином и фосфолипазой А. В результате лизиса мембран клеток и цитоплазматических гранул секрет этих гранул, содержащий гистамин, гепарин, серотонин и другие вещества, выбрасывается в межклеточное пространство, приводя к названным эффектам. При изучении этих эффектов, а также выделения отдельных компонентов яда было установлено, что выброс секрета из тучных клеток может происходить и без их лизиса. Fredholm (1966) и Habermann (1967) выделили и охарактеризовали такой компонент яда, назвав его МСД-пептидом (т.е. пептидом де-гранулируюшим тучные (мастоцитные) клетки). Позднее другие авторы и другими методами охарактеризовали пептид со сходными свойствами и структурой, дав ему порядковое название изученных в лаборатории пептидов — 401 (Vernon et al., 1969 и др.).
МСД-пептид состоит из 22 аминокислотных остатков с соответствующей молекулярной массой 2588. Проявляет ярко выраженные основные свойства (изоэлектрический оптимум рН 12), зависящие от наличия 9 основных аминокислот. С-конец молекулы ами-дирован. Обращает на себя внимание большое структурное свойство МСД-пептида с апамином. И в том и другом имеются две ди-сульфидные связи, их молекулы близки по своей длине, не содержат ароматических аминокислот, метионина, ссрина и треонина. Однако на этом сходство и кончается, так как физиологическая активность существенно различается.. Так, апамин не оказывает действия на тучные клетки, а пептид 401 не влияет на нехолинергиче-
скую и неадренергическую нервную регуляцию гладких мышц и не дает нейротоксических эффектов при системном введении в организм. Его внутрижелудочковое введение крысам производит эффекты, если доза превышает таковые для апамина в 10 раз. Полагают, что различие в эффектах обеспечивается различием вторичной и третичной структуры, пептидов.
По своей активности высвобождать биогенные амины из тучных клеток МСД-пептид значительно превосходит мелиттин и фосфолипазу А (в 10-100 раз). При этом механизм такой активности различен. Если фосфолипаза и мелиттин высвобождают секрет, разрушая клеточные и внутриклеточные мембраны, то МСД-пептид высвобождает гистамин из гранул тучных клеток посредством слияния гранул с клеточной мембраной, приводящего к экзо-цитозу — содержимое гранул выбрасывается во внеклеточное пространство без лизиса тучных клеток. В этом плане пептид яда можно отнести к специфическим «гистамин-либераторам», типа синтетического соединения 4880.
Физиологические свойства пептида вытекают из его механизмов действия. Однако здесь много неясного. С одной стороны, понятны воспалительные реакции, возникающие сразу после ужале-ния: гистамин вызывает увеличение кровоснабжения в данном участке, увеличение проницаемости капилляров с соответствующим отеком и т.д. Здесь многое будет определяться тем, какие тучные клетки и каких тканей преимущественно будут вовлекаться в процесс. Например, показано, что мыши нечувствительны к пептиду из-за того, что их тучные клетки не реагируют на него, в то же время, как у крыс симптомы интоксикации возникают уже при внутривенном введении 5 мг/кг из-за мощного выброса гистамина из тучных клеток. У человека дегрануляция тучных клеток во многом провоцирует аллергические реакции, такие как сенная лихорадка, астма, псориаз и др. Ясно, что действие пептида на организм человека может приводить к усилению указанных негативных реакций.
С другой стороны, открытие пептида 401 было установлено в условиях моделирования воспалительных реакций и угнетения этих реакций названным пептидом. То есть, воспалительное действие оказалось противоположным — противовоспалительным. Указанный парадокс трудно объясним. Тем не менее, установлено, что на разных моделях воспаления пептид 401 обладает выраженным противовоспалительным действием. Billingham et al. (1969, 1973) установили, что на модели каррагининового воспаления лапы крыс пептид оказался в 100 раз активнее, чем известный проти-
скую и неадренергическую нервную регуляцию гладких мышц и не дает нейротоксических эффектов при системном введении в организм. Его внутрижелудочковое введение крысам производит эффекты, если доза превышает таковые для апамина в 10 раз. Полагают, что различие в эффектах обеспечивается различием вторичной и третичной структуры пептидов.
По своей активности высвобождать биогенные амины из тучных клеток МСД-пептид значительно превосходит мелиттин и фосфолипазу А (в 10-100 раз). При этом механизм такой активности различен. Если фосфолипаза и мелиттин высвобождают секрет, разрушая клеточные и внутриклеточные мембраны, то МСД-пептид высвобождает гистамин из гранул тучных клеток посредством слияния гранул с клеточной мембраной, приводящего к экзо-цитозу — содержимое гранул выбрасывается во внеклеточное пространство без лизиса тучных клеток. В этом плане пептид яда можно отнести к специфическим «гистамин-либераторам», типа синтетического соединения 4880.
Физиологические свойства пептида вытекают из его механизмов действия. Однако здесь много неясного. С одной стороны, понятны воспалительные реакции, возникающие сразу после ужале-ния: гистамин вызывает увеличение кровоснабжения в данном участке, увеличение проницаемости капилляров с соответствующим отеком и т.д. Здесь многое будет определяться тем, какие тучные клетки и каких тканей преимущественно будут вовлекаться в процесс. Например, показано, что мыши нечувствительны к пептиду из-за того, что их тучные клетки не реагируют на него, в то же время, как у крыс симптомы интоксикации возникают уже при внутривенном введении 5 мг/кг из-за мощного выброса гистамина из тучных клеток. У человека дегрануляция тучных клеток во многом провоцирует аллергические реакции, такие как сенная лихорадка, астма, псориаз и др. Ясно, что действие пептида на организм человека может приводить к усилению указанных негативных реакций.
С другой стороны, открытие пептида 401 было установлено в условиях моделирования воспалительных реакций и угнетения этих реакций названным пептидом. То есть, воспалительное действие оказалось противоположным — противовоспалительным. Указанный парадокс трудно объясним. Тем не менее, установлено, что на разных моделях воспаления пептид 401 обладает выраженным противовоспалительным действием. Billingham et al. (1969, 1973) установили, что на модели каррагининового воспаления лапы крыс пептид оказался в 100 раз активнее, чем известный проти-
вовоспалительный агент гидрокортизон. При внутривенном введении пептида в дозе 200 мкг/кг он полностью снимал отек воспаленной лапы крыс, вызванный брадикинином, простагландином Е, се-ротонином, каликреином и гистамином. Инъецированный под кожу до моделирования воспаления, пептид 401 в дозе 3 мг/кг на 80% снижал воспалительный процесс в коленном суставе, вызванный введением скипидара.
Факты проявления противовоспалительной активности МСД-пептида интересны тем, что она не зависит от нейро-гормональ-ной регуляции и проявляется на адреналэктомированных животных. Однако имеется определенная корреляция между проявлением противовоспалительной активности и дегрануляцией тучных клеток с высвобождением гистамина. Рядом авторов установлено, что при блокировании дегрануляции тучных клеток противовоспалительная активность МСД-пептида, впрочем, как и 48/80, уменьшается. В связи с этим Banks et al. (1985) полагают, что пептид не относится к естественным противовоспалительным агентам и не проявляет активности там, где нет высвобождения гистамина из тучных клеток. В соответствии с этим, вышеназванные эксперименты особенно хорошо воспроизводятся на крысах с их мощной реакцией гистаминоосвобождения на введение пептида и неэффективны на морских свинках, тучные клетки которых устойчивы к нему. Видимо, считают авторы, высвобождение гистамина под влиянием пептида является пусковым звеном пока еще неизвестного механизма противовоспалительного действия. Возможно, этот механизм работает на уровне эндотелия капилляров, препятствуя разрыхлению их стенки. Противоречие между воспалительным и противовоспалительным эффектами может быть разделено во времени и интенсивности воздействия пептида, определяемого вводимой дозой.
Оценивая участие МСД-пептида в суммарной картине противовоспалительного действия цельного яда, кроме известных цитоли-тиков — мелиттина и фосфолипазы, следует учесть, что в составе яда есть и другие компоненты, обладающие противовоспалительными свойствами. Кроме того, следует учитывать их потенцирующее друг друга действие. Так, Шкендеров, Иванов (1985), изучая МСД-пептид, загрязненный мелиттином, выявили, что для снятия воспалительной реакции крыс требовалась доза в 200 раз меньше, чем доза пептида 401.
Высокая противовоспалительная активность пептида, особенно при его комбинации с другими компонентами яда, своеобразный
механизм действия, отсутствие значимых аллергических реакций, делают МСД-пептид перспективным, научно обоснованным, лекарственным средством в ряду нестероидных противовоспалительных средств.
Другие пептиды пчелиного яда. Кроме вышеперечисленных в состав яда пчел входят и другие пептиды. Содержание их исчисляется долями процента и присутствие выявлено не у всех видов пчел. Один из них — секолин — содержит, по данным разных авторов, от 22 до 25 аминокислотных остатков, с большим содержанием пролина и тирозином на N-конце, имеет один дисульфидный мостик. Неактивен в отношении млекопитающих. Другой — тертпиа-пин — содержит 20 аминокислотных остатков с N-концевой группой аланином, подобно апамину имеет два дисульфидных мостика и, видимо, подобную структуру молекулы. Подобно секапину не обладает биологической активностью по отношению к млекопитающим, если не считать факта пресинаптического действия на нервно-мышечный препарат лягушки, где установлено его блокирующее нейромедиацию действие (Овчинников и др., 1980). Ряд небольших пептидов — прокамины — содержащих 5 аминокислотных остатков, выделен из яда канадской пчелы. Эти пептиды обладают уникальной особенностью — на С-конце к молекуле присоединен гистамин. Укажем, что такие гистаминсодержащие пептиды ранее в природных источниках не были известны, что может представлять большой интерес в плане использования таких агентов в физиологии и фармакологии. Ряд исследователей полагают, что именно такие пептиды могут опосредовать радиозащитный эффект пчелиного яда, установленный рядом авторов. Недавно выделено еще несколько пептидов с неустановленной еще структурой. Среди них — минимин — обладающий способностью тормозить нарастание массы тела личинок дрозофил, миниатюризируя их взрослые формы (отсюда — минимин), кардиопеп — влияющий на препараты сердца животных и др. Сегодня считается, что указанный ряд пептидов присутствует в яде для поражения беспозвоночных животных, обычных врагов пчел и образуется из своих неактивных предшественников — протоксинов (Kreil, 1981). Автор полагает, что многие из указанных пептидов, включая мелиттин, сек-ретируются ядовитой железой в неактивной форме в виде пептидов из 10-20 аминокислотных остатков и при активации разделяются
на небольшие активные пептиды. При этом, кроме перечисленных, образуются небольшие ди- и три- пептиды с невыявленной активностью.
При анализе противовоспалительных и обезболивающих свойств пчелиного яда Шкендеровым и др. (1982) был охарактеризован еще один пептид яда, названный авторами «адолапин» (от антидолор — противоболевой). Однако доказательство присутствия этого пептида проблематично. Во всяком случае, Banks с со-авт. (1983), повторившие методики выделения болгарских исследователей, не обнаружили пептида, на основании чего предположили, что наблюдаемый противоболевой эффект принадлежал фос-фолипазе А. Тем не менее, Шкендеров, Иванов (1985) указывают, что молекулярная масса адолапина составляет около 11000 Да, его полипептидная цепь состоит из 103 аминокислотных остатков, в ней нет цистеина, метионина, триптофана, а на N-конце находится глицин. Адолапин угнетает активность двух ключевых ферментов процесса воспаления — циклооксигена.зу и липооксигеназу, тем самым угнетая синтез простагландинов. Адолапин снижает воспалительные свойства простагландинов Е. Авторы указывают, что противовоспалительная активность различна в зависимости от моделируемого воспаления — лучшие эффекты достигаются при каррагениновом и простагландиновом, хуже при брадикининовом, серотониновом и гистаминовом воспалении. Выраженное болеутоляющее действие адолапина связывается с замедлением синтеза простагландинов Е. Авторы делают заключение, что адолапин является новым классом фармакологически активных веществ — природных ингибиторов циклооксигеназы и липооксигеназы—пеп-тидной природы с болеутоляющими свойствами.
Протеазные ингибиторы. Еще одна группа пептидов пчелиного яда, открытая сравнительно недавно (Шкендеров с соавт., 1973), принципиально отличается от вышеназванных пептидов по своему биологическому назначению. Дело в том, что в тканях животных организмов наряду с ферментами обычно присутствуют и ингибиторы этих ферментов — видимо, для авторегуляции активности ферментов в процессе обмена веществ (как сдерживающий фактор). Целесообразность присутствия протеазных ингибиторов в змеиных ядах, показанного Takachashi et al. (1972) также объяснима с позиции сохранения активности протеолитических ферментов ядов змей в ядовитых железах. Присутствие же таких ингибиторов в пчелином яде, в котором отсутствуют протеолитические фермен-
ты, заставляет предположить, что они предназначены для защиты белковых и пептидных компонентов яда при его попадании в ткани организма жертвы — от разрушительного действия тканевых протеаз. Болгарскими исследователями выделены два ингибитора, угнетающих активность трипсина, химотрипсина, плазмина, тромбина и др. протеолитических ферментов. Авторы указывают, что широкий спектр протеазного действия ингибиторов пчелиного яда делает их похожими на поливалентный ингибитор из органов крупного рогатого скота, применяемый в медицине как эффективное средство при лечении острых панкреатитов, фибринолиза, шоковых состояний.
Установлена противовоспалительная активность ингибиторов протеаз. Полагают, что такая активность может быть обусловлена угнетением активности ряда протеаз, участвующих в воспалительном процессе. Протеазные ингибиторы пчелиного яда также обладают выраженной противовоспалительной активностью, установленной авторами на разных моделях воспаления.
Один из ингибиторов представляет собой полипептидную цепь из 52 аминокислот с большим количеством аргинина и лизина, что определяет основные свойства пептида.
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ АМИНЫ
Кроме белков и пептидов, составляющих основную массу секрета ядовитых желез пчел, в пчелином яде содержатся множество низкомолекулярных соединений. Наиболее значимые из них — биологически активные амины — гистамин, серотонин, допамин, норадреналин. Эти вещества участвуют во многих процессах организма, но наиболее важная их функция — обеспечение межклеточного взаимодействия. Только благодаря такому взаимодействию возможны реакции возбуждения и торможения в нервной системе.
Гистамин. Один из наиболее важных и постоянных компонентов пчелиного яда. Как уже было отмечено, его содержание в ядовитом резервуаре железы увеличивается с возрастом пчелы. При попадании в организм млекопитающих гистамин вызывает болевой эффект ужаления. При этом необходимо суммировать эффекты не только гистамина яда, но и гистамина, выделяющегося из тучных клеток подкожной клетчатки под действием мелиттина, МСД-пептида и фосфолипазы А. Гистамин обладает свойством расширять кровеносные сосуды и увеличивать проницаемость их стенок. В соответствии с этим гистамин яда, также, как и МСД-пептид,
можно отнести к факторам распространения яда в организме. Вместе с тем, повышение уровня гистамина приводит к возрастанию других физиологических веществ организма — простагландинов, серотонина, адреналина и др., которые приводят к существенной перестройке состояния организма, в частности, его возбуждению, стрессовому состоянию. Возможно, именно эта совокупность реакций на ужаление — рефлекторная на боль и возрастание уровня ФАВ приводят к стойкому повышению активности гипофизарно-надпочечниковой системы.
Катехоламины яда — допамин и норадреналин содержатся в яде в очень незначительных количествах, чтобы производить эффекты на организм млекопитающих. Однако их уровень при попадании в гемолимфу (внутреннюю среду) повседневных врагов—членистоногих, видимо, достаточен, чтобы вызвать необходимые эффекты. Следует отметить, что и допамин, и норадреналин являются обычными посредниками в межклеточных взаимодействиях насекомых, межнейронной передачи информации. Таким образом может производиться дезинтеграция функции ЦНС членистоногих с нарушением важнейших функций организма. Показано, что сравнимое с ужалением повышение указанных катехоламинов в гемолимфе насекомых, приводит к повышению частоты сердечных сокращений (Owen, 1977). На этом примере видно, что, с одной стороны, компоненты яда, в данном случае катехоламины, производят непосредственный нейротоксический эффект, а с другой — опосредованно, за счет усиления лимфообращения (или кровообращения) способствуют распространению основных компонентов яда в организме.
Летучие вещества яда (аттрактанты, феромоны). Эти вещества, выделяющиеся в момент ужаления, не обнаруживаются в коммерческих препаратах яда. Таких соединений обнаружено в нативном яде около 20, часть из них охарактеризована (Collins et al., 1982). 4 летучих соединения обладают выраженной активностью в произведении реакции тревоги, видимо, из-за небольшой молекулярной массы, соответственно, высокой летучестью по сравнению с остальными — высокомолекулярными.